घर पर खुद DNA sequencing करना

 (bradleywoolf.com)
1 पॉइंट द्वारा GN⁺ 4 시간 전 | 1 टिप्पणियां | WhatsApp पर शेयर करें
  • जो लोग व्यक्तिगत उपकरणों से genome sequencing आज़माना चाहते हैं, उनके लिए गाल की कोशिकाएँ इकट्ठा करने से लेकर VCF analysis तक की वास्तविक home lab प्रक्रिया और ज़रूरी उपकरण एक ही flow में व्यवस्थित किए गए हैं
  • प्रयोग के sample के रूप में इस्तेमाल होने वाली गाल के अंदरूनी हिस्से की कोशिकाएँ आसानी से मिल जाती हैं, लेकिन cancer diagnosis या किसी खास tissue की inflammation·gene expression analysis जैसे tissue context वाले सवालों के लिए उपयुक्त नहीं हैं
  • genomic data की असली उपयोगिता तुरंत diagnosis पाने में कम, और VCF को queryable reference layer बनाकर VEP, ClinVar, gnomAD, PharmGKB, Gene Inspector, Claude आदि से variants खंगालने में ज़्यादा है
  • तैयारी में लगभग दो महीने लगे, और सिर्फ MinION ही लगभग 7,500 डॉलर का है, इसलिए उपकरण, reagents, consumables और analysis environment सब मिलाकर अभी भी औसत व्यक्ति के लिए लागत एक बड़ी बाधा है
  • low-input·low-coverage run को medical-grade interpretation नहीं बल्कि तकनीकी सत्यापन की तरह देखना चाहिए, और low-coverage variants की अतिव्याख्या न करना महत्वपूर्ण है

घर पर DNA sequencing की सीमा और सीमाएँ

  • यह अपने genome को Oxford Nanopore Technologies MinION से 5 बार sequence करने के अनुभव पर आधारित है
    • गाल के अंदरूनी हिस्से की कोशिकाएँ swab से इकट्ठा की जाती हैं
    • sequencing के लिए sample तैयार किया जाता है
    • sequencer पर लोड किया जाता है
    • परिणाम डेटा का analysis किया जाता है
  • गाल की कोशिकाएँ आसानी से मिल जाती हैं और जल्दी फिर से बन जाती हैं, लेकिन हर biological सवाल के लिए उपयुक्त नहीं हैं
    • cancer diagnosis के लिए इनका उपयोग नहीं किया जाता
    • inflammation diagnosis या शरीर के दूसरे हिस्सों में सक्रिय genes की पहचान के लिए यह सही नहीं है
    • छाती पर दाने वाले हिस्से की inflammatory cells में व्यक्त होने वाले genes देखने हों, तो समस्या वाली कोशिकाओं और सामान्य कोशिकाओं की तुलना करनी होगी
  • पूरी तैयारी में लगभग दो महीने लगे, और लागत अभी भी औसत व्यक्ति की पहुँच से बाहर है
    • लागत घट रही है
    • लंबी अवधि में, मोबाइल फोन या AI की तरह DNA और RNA expression को real time में बताने वाली तकनीक संभव हो सकती है

genomic data से क्या किया जा सकता है

  • genome कोई “जादू” नहीं बल्कि एक reference layer है, और VCF होने पर उसे कई tools से query किया जा सकता है
  • उपयोग किए जा सकने वाले tools हैं VEP, ClinVar, gnomAD, PharmGKB, Gene Inspector, Claude आदि
  • VCF के आधार पर ये सवाल देखे जा सकते हैं
    • कौन से variants मौजूद हैं
    • कौन से genes और pathways प्रभावित होते हैं
    • कौन सी दवाओं का metabolism अलग तरीके से हो सकता है
    • किन rare variants को गंभीरता से देखना चाहिए
    • ऐसे कौन से क्षेत्र हैं जिन्हें मॉडल अभी नहीं समझता
  • बनने वाली जानकारी अभी diagnostic level की नहीं है
    • इसका मतलब यह भी नहीं कि “AI ने कहा है, इसलिए CRISPR से खुद को edit कर लो”
    • निकट अवधि की उपयोगिता static genome को queryable रूप में बदलने में है
  • DNA एक स्थिर reference है और RNA वर्तमान स्थिति के अधिक करीब है, और लंबी अवधि में biosensor data को व्यक्ति के एक मॉडल में integrate किया जा सकता है

ज़रूरी उपकरण और consumables

  • मुख्य hardware Oxford Nanopore Technologies MinION है, जिसकी कीमत 7,500 डॉलर है
    • MinKNOW चलाने के लिए laptop या workstation
    • output storage के लिए 100GB या उससे अधिक storage
    • Dorado basecalling के लिए GPU
    • Vortex, heat block, centrifuge
  • मुख्य consumables में ONT sequencing kit, flow cell washing kit, control material, PBS, और cheek cell swabs शामिल हैं
  • reagents को DNA extraction, library preparation, flow cell priming, और quantification में बाँटा गया है
  • bench equipment और plastic consumables भी अलग से चाहिए
    • microcentrifuge, magnetic rack, tube racks, ice bucket, -20°C freezer, 4°C fridge, pipettes
    • sterile cheek swabs, LoBind tubes, PCR tubes, Qubit assay tubes, filtered tips, wide-bore P200 tips, gloves

प्रयोग का flow: sample collection से final library तक

  • पूरा लक्ष्य गाल swab sample 2 को MinION sequencing के लिए उपयुक्त library में बदलना है
  • तैयारी के चरणों में gloves पहनना, bench साफ करना, tubes पर label लगाना, AMPure XP beads को room temperature पर लाना, enzymes को ठंडा रखना, heat block को 56°C पर सेट करना, और ONT reagents की जाँच शामिल है
  • कोशिकाएँ इकट्ठा करने और concentrate करने की प्रक्रिया में गाल के अंदरूनी हिस्से को 60 सेकंड तक रगड़कर PBS में डालना, फिर centrifuge से छोटा सफेद या धूसर pellet पाना शामिल है
    • PBS थोड़ा धुंधला हो सकता है
    • pellet को aspirate न करना महत्वपूर्ण है
  • Monarch kit से कोशिकाओं को lyse किया जाता है और DNA को capture beads से bind कराया जाता है
    • lysis के बाद high-molecular-weight DNA को सुरक्षित रखना प्राथमिकता है, इसलिए vortex का उपयोग नहीं किया जाता
    • DNA-bound beads खोने नहीं चाहिए
    • gDNA Wash Buffer में ethanol पहले से मिला होना चाहिए
  • purified genomic DNA को Qubit से quantify किया जाता है
    • 1x dsDNA High Sensitivity का उपयोग किया जाता है
    • अगर sample concentration बहुत कम हो, तो नए Qubit tube में ज़्यादा DNA लेकर फिर से मापें
    • मौजूदा tube में सिर्फ DNA जोड़ने से assay की गणना बिगड़ जाती है
  • अस्थायी pause के लिए सबसे अच्छा समय DNA extraction के तुरंत बाद है
    • DNA LoBind tube पर साफ label लगाएँ
    • quick spin के बाद vortex किए बिना 4°C पर refrigerate करें

library preparation और flow cell loading

  • ideal repair/end-prep input है 1,000ng DNA in 47µL
    • अगर DNA इतना dilute हो कि 47µL में 1,000ng न आए, तो जितना संभव हो उतना अधिक volume इस्तेमाल करें
    • पहले low-input run का उदाहरण 0.296ng/µL × 47µL यानी लगभग 13.9ng था, जो recommended input से बहुत कम था, लेकिन end-to-end practice के लिए उपयोगी रहा
  • repair/end-prep में FFPE DNA Repair Buffer v2, FFPE DNA Repair Mix, N-Prep Enzyme Mix का उपयोग होता है
    • Salt-T4 DNA Ligase इस चरण में नहीं, बाद में उपयोग होता है
    • अगर DCS का उपयोग नहीं कर रहे हों, तो optional 1µL DCS की जगह nuclease-free water डालें
  • AMPure cleanup के बाद adapter ligation से ONT sequencing adapters जोड़े जाते हैं
    • reaction में repaired/end-prepped DNA, LNB, Salt-T4 DNA Ligase, LA शामिल होते हैं
    • LA हटाने पर sequencing योग्य library नहीं बनती
    • Salt-T4 DNA Ligase हटाने पर adapter ligation विफल हो जाता है
    • LNB को ठीक से mix न करने पर ligation chemistry खराब हो जाती है
    • vortex से DNA shearing हो सकती है, इसलिए इससे बचते हैं
  • adapter-ligated library cleanup में ethanol नहीं बल्कि LFB का उपयोग होता है
    • व्यावहारिक नियम है: “Liquid moves. Beads stay.”
    • final library में beads को transfer नहीं किया जाता
  • final library को भी Qubit से फिर से quantify किया जाता है
    • low-input run में value कम आ सकती है या measurement विफल हो सकती है
    • practice run में library को Qubit में बार-बार खर्च करने के बजाय 12µL library से loading mix बनाया जा सकता है

MinION run और data processing

  • MinKNOW में flow cell की जाँच करें और active pores नोट करें
    • 1200 से अधिक: अच्छा
    • 800–1200: उपयोग योग्य
    • 500–800: सीमा पर या practice के लिए
    • 500 से कम: खराब, लेकिन mechanical practice संभव
    • 200 से कम: loading practice के अलावा व्यावहारिक रूप से मूल्य बहुत कम
  • final चरण में तीन tubes संभाले जाते हैं
    • Final library: adapter cleanup के बाद की DNA library
    • Priming mix: flow cell तैयार करने के लिए
    • Loading mix: final library, sequencing buffer, library beads शामिल
  • flow cell में दो ports होते हैं
    • Priming port: sliding cover के नीचे होता है और इसमें priming mix डाला जाता है
    • SpotON sample port: छोटा sample well, जिसमें loading mix एक-एक बूंद डालते हैं
  • Final library को सीधे flow cell पर नहीं डाला जाता, बल्कि पहले loading mix tube में डाला जाता है
  • MinKNOW की default settings इस प्रकार हैं
    • Flow cell type: FLO-MIN114
    • Kit: SQK-LSK114
    • Basecalling: ON
    • Model: High-accuracy / HAC
    • Barcoding: OFF
    • Alignment: OFF
    • Adaptive sampling: OFF
    • Raw reads / POD5: ON
    • Filtering: low-input practice run में OFF
  • low-input practice run में live output अच्छा न दिखे तब भी बाद में analysis के लिए raw POD5 चालू रखना recommended है

analysis pipeline

  • ज़रूरत हो तो run के बाद Dorado से basecalling करें
    • dorado basecaller sup pod5_directory/ > calls.bam
    • ज़रूरत होने पर samtools fastq calls.bam > reads.fastq से FASTQ में बदलें
    • तेज़ पहली जाँच के लिए SUP की जगह HAC इस्तेमाल किया जा सकता है
  • human reference के लिए GRCh38 FASTA का उपयोग करें
    • minimap2 से reference index बनाएँ
    • map-ont से reads को align करें
    • samtools से BAM index और flagstat बनाएँ, और mosdepth से coverage जाँचें
  • variant calling के लिए Clair3 और ONT model का उपयोग करें
    • output में VCF शामिल होना चाहिए
    • low-coverage variants की अतिव्याख्या न करें
    • पहली MinION run को medical-grade interpretation नहीं बल्कि तकनीकी सत्यापन की तरह लें
  • annotation के लिए VEP install करके GRCh38 के आधार पर VCF annotate करें
    • ClinVar, gnomAD, PharmGKB जोड़ें
    • final table में chromosome, position, ref, alt, gene, consequence, ClinVar significance, gnomAD frequency, genotype, read depth, variant quality शामिल हों

संदर्भ सामग्री

  • Seth Howes protocol: घर पर genome sequence करने की लागत और protocol के लिए संदर्भ सामग्री
  • Quantifying Life: इसे बहुत कम आंका गया संसाधन बताया गया है
  • Integrated Drug Discovery Technologies: इसे संदर्भ पुस्तक के रूप में पेश किया गया है

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1 टिप्पणियां

 
GN⁺ 4 시간 전
Hacker News की राय

  • मैं घर पर खुद sequencing नहीं करना चाहूँगा, लेकिन ऐसी third-party service के साथ इसे आज़माना चाहूँगा जो पूरा raw data दे
    मैं यूरोप में रहने वाला एक सामान्य consumer हूँ, इसलिए जानना चाहता हूँ कि कौन-सी service इस्तेमाल करनी चाहिए। अगर provider अपनी तरफ data store न करे तो यह बड़ा फायदा होगा, लेकिन पता नहीं क्या इतनी मांग की जा सकती है

    • third-party database आखिरकार leak हो सकते हैं, इसलिए उस समय DNA बदलना भी मत भूलिएगा
      23andMe leak case देखें: https://en.wikipedia.org/wiki/23andMe_data_leak
    • YSEQ असल में लगभग एक छोटे family-run business जैसा है। Family Tree DNA की Texas lab setup में मदद करने वाले दो German scientists जर्मनी लौटे और genealogists के लिए high-resolution Y-DNA sequencing में एक छोटा competitor शुरू किया
      अनुरोध करने पर वे high-resolution whole genome sequencing भी कर देते हैं। हालांकि इसमें काफी समय लगता है, और देरी की शिकायत करने पर वे order cancel करने का अधिकार रखते हैं। यह सबसे सस्ता विकल्प नहीं है, लेकिन यूरोपीय privacy के नजरिए से काफ़ी अच्छा लगता है। जितनी ज़्यादा privacy अहम हो, उतनी ही थोड़ी “deal करने में मुश्किल” company शायद बेहतर हो सकती है
    • पहले एक conference की वजह से इलाके में आए एक cancer researcher से मेरी अचानक मुलाकात हुई और मैंने यही सवाल पूछा, तो उन्होंने कहा कि किसी local lab की website पर listed contact person से सीधे संपर्क करके पूछो कि क्या वे मदद कर सकते हैं, या कहाँ जाना चाहिए
      उन्होंने कहा कि वे कई देशों में खुद ऐसा कर चुके हैं, लेकिन अभी भी नहीं जानता कि लोगों ने उनकी job title की वजह से मदद की या नहीं। फिर भी, उनका भरोसा था कि अगर आप बस एक software engineer भी हों तो कोई न कोई मदद करने वाला मिल सकता है। अगर पास में कोई lab हो तो कोशिश करने लायक है
    • myheritage इस्तेमाल करने के बाद मैंने सारा data export कर लिया, फिर account बंद करने और data delete करने का अनुरोध किया
      इसे चुनने का मुख्य कारण यह था कि उस समय 30 euro का low-cost product उपलब्ध था
    • मुझे long-read raw data चाहिए। मैं यूरोप, खासकर जर्मनी में रहने वाला एक सामान्य consumer हूँ, इसलिए जानना चाहता हूँ कि क्या ऐसी third-party service मौजूद है जो यह देती हो, और इसकी कीमत कितनी होगी
      long read की ज़रूरत इसलिए है क्योंकि जिस जानकारी की मुझे तलाश है वह लगभग एक जैसी duplicate genes में है। मेरे पास Dante Labs से मिले FASTQ और BAM files हैं, लेकिन उनसे मैं अपनी ज़रूरी जानकारी नहीं निकाल पाया

  • “यह दस्तावेज़ AI के पढ़ने के लिए बनाया गया है, इसलिए URL कॉपी करके ChatGPT में पेस्ट करें और निर्देश लें। अगर आपके पास AR glasses हों तो AI आपको पूरा protocol follow कराने में मदद कर सकता है” — यह किस तरह की जादू जैसी बात है, समझ नहीं आया

    • लेखक के हिसाब से इसका मतलब hands-free procedural guidance था। इसे ChatGPT या Claude में डालकर बातचीत करते हुए follow करना, हर बार computer screen पर लौटकर देखने की तुलना में procedure पूरा करना आसान बनाता था, और context switching भी कम होती थी
      आप इसे खुद पढ़ भी सकते हैं, लेकिन सामग्री काफी घनी है
    • शायद मकसद specific लेकिन compressed notes देना है, और जहाँ विवरण कम हो वहाँ large language model उसे step-by-step guidance से भर दे
    • यह काफ़ी smart approach लगती है। बहुत-से लोग blog post खुद पढ़ने के बजाय GPT को text समझाकर उसका summary या सिर्फ़ ज़रूरी हिस्सा निकलवाएँगे, तो लेखक ने सामग्री को उस आम post-processing step के output के लिए optimize किया है

  • मैंने कभी ऐसी company के बारे में सोचा था जो sewer line से roots निकालकर, ज़रूरत पड़ने पर sequencing से पहचान करे कि वह कौन-सा plant है, और फिर बताए कि sewer line collapse होने से पहले किसे मारना चाहिए
    अगर कुछ सालों तक 10,000 dollar की sewer replacement टाली जा सके, तो मुझे लगता है बहुत लोग 100 dollar देने को तैयार होंगे

    • https://www.envirodna.com/

      https://www.naturemetrics.com/species-detection

      https://www.ednacollab.org/industry/

      https://wilderlab.co/

      ये कंपनियाँ environmental DNA पर फोकस करती हैं। कुछ local government monitoring के ज़्यादा करीब हैं, और कुछ individual customers को भी target करती हैं

    • मुझे समझ नहीं आता कि इसकी ज़रूरत क्यों है। किसी खास plant को मारने का तरीका, उन सभी plants को target करने वाले तरीके से कितना बेहतर होगा जो वहाँ हो सकते हैं? अलग-अलग तरह के herbicide treatment को combine भी किया जा सकता है, और शायद ऐसे विकल्प इस service की cost से सस्ते हों

    • यह सच में बहुत clever idea है, और अगर सही conditions हों तो मैं निश्चित रूप से इसके लिए पैसे दूँगा
      लेकिन सोचने पर लगता है, क्या drain में biodegradable broad-spectrum herbicide डालकर वही असर कम खर्च में नहीं पाया जा सकता?

    • मैं सोच रहा हूँ कि पर्याप्त लोगों को इस service के बारे में पता चलवाकर order तक कैसे पहुँचाया जाएगा। यहाँ मुझे minimum viable business opportunity जैसी बात दिखती है

    • 100 dollar से कम में plumber को घर के दरवाज़े तक लाना भी मुश्किल है। समझ नहीं आया कि 500 dollar कहना था, या 100 dollar सिर्फ़ lab analysis वाले हिस्से के लिए था

  • काश results पर भी कुछ चर्चा होती। इस sensor और process पर पहले की reports में काफ़ी mixed evaluation रहे हैं
    process खुद तो बढ़िया है, लेकिन मैं जानना चाहता हूँ कि real-world environment से निकला output कितना उपयोगी है

  • https://www.the-odin.com/whole-genome-sequencing-30x/

    अगर जल्दी और तुलनात्मक रूप से सस्ता करना हो, तो 599 dollar का एक विकल्प है

    • अगर lab अमेरिका आधारित है, तो क्या वह CLIA और उसकी retention requirements के दायरे में नहीं आएगी?
      7,500 dollar या उससे ज़्यादा में आपको guaranteed privacy मिल सकती है। बाकी गुण comments में बताए अनुसार अलग हो सकते हैं, लेकिन कम से कम data घर से बाहर नहीं जाएगा
    • service और equipment एक ही चीज़ नहीं हैं

  • मैं sequencing करना चाहता/चाहती हूँ, लेकिन नहीं चाहता/चाहती कि कोई company, government, या religious group मेरे data तक पहुँच सके
    जब लेखक ने कहा कि “अगर आपके पास VCF है, तो आप उसे VEP, ClinVar, gnomAD, PharmGKB, Gene Inspector, Claude जैसे tools में चला सकते हैं”, तो क्या इसका मतलब यह नहीं कि मेरा data उन्हीं पक्षों के हाथ में चला जाएगा जिनसे मैं बचना चाहता/चाहती हूँ?

    • VEP, ClinVar, gnomAD के मामले में ऐसा नहीं है। ये या तो offline इस्तेमाल किए जा सकने वाले open source tools हैं या databases हैं। आप इन्हें download करें या query करें, किसी को पता नहीं चलेगा
      लेकिन Claude को data भेजना सही है। फिर भी वह चरण अनिवार्य नहीं है। standard pipeline चलाने पर आपको genome variants वाला VCF file मिलता है, और हर variant पर annotation जोड़ा जा सकता है। annotated genes देखकर यह आकलन किया जा सकता है कि variant pathogenic है, likely pathogenic है, कम pathogenic है, या benign है

  • यह सचमुच हैरान करने वाली बात है कि हथेली जितनी छोटी चीज़ से ऐसा किया जा सकता है। अगर इसी आकार के CRISPR device भी आ गए, तो यह अब Gattaca की कहानी जैसा होने लगेगा, इसलिए शायद यहीं रुक जाना चाहिए

  • मैंने wet lab में DNA collection और sequencing की है, लेकिन वह लगभग 20 साल पहले की बात है; तब भी यह काम मुश्किल था और अक्सर fail हो जाता था। खासकर अगर environment बहुत ज़्यादा साफ न हो, तो failure और भी ज़्यादा होता है
    data मिल जाने के बाद भी, collection environment को देखते हुए खुद से पूछना चाहिए कि यह कितना accurate है, और correlated sequencing errors भी देखने चाहिए जिन्हें शायद ध्यान में न रखा गया हो। साथ ही, genetic counseling वास्तव में एक ऐसा विशेषज्ञ क्षेत्र है जिसे लोग पढ़ते हैं। अपने gene data का अपने लिए क्या मतलब है, यह किसी large language model से पूछने से पहले, आपको ऐसे व्यक्ति तक पहुँच होनी चाहिए जो data को context में रख सके और आपको संबंधित experts से जोड़ सके। इस क्षेत्र में PhD होने पर भी, मुझे भरोसा नहीं कि मैं अपने data की पूरी तरह निष्पक्ष और तर्कसंगत व्याख्या कर पाऊँगा/पाऊँगी
    अतिरिक्त रूप से, समझ नहीं आता कि Molecular Biology of the Cell का link 4 साल पहले आए 7th edition के बजाय 6th edition का क्यों है। पहले तीन editions में मेरे पहले PhD के दौरान मेरे advisor सह-लेखक थे, और वही वह व्यक्ति थे जिन्होंने दिखाया था कि Roger Penrose का यह विचार कि E. coli की chemotaxis में microtubules महत्वपूर्ण हैं, पूरी तरह बकवास था। वह शानदार इंसान थे। 2007 में मैंने Illumina data का analysis किया था, जब वह commercial रूप से अभी बहुत शुरुआती दौर में था, और reference genome के साथ align करके कुछ खास biases की पहचान की जा सकती थी। nanopore technology में ऐसे biases और भी अधिक होने की संभावना है, और अगर उन्हें ध्यान में रखने की क्षमता न हो, तो बड़ी मुश्किल हो सकती है

    • nanopore data का analysis short-read sequencing data की तुलना में बहुत आसान है। reads बहुत लंबे होते हैं, इसलिए वही alignment/assembly समस्याएँ नहीं आतीं
      biochemistry में master's करने वाले के रूप में मेरी भी यही राय है
    • Oxford Nanopore sequencing technology इस्तेमाल के लिहाज़ से काफ़ी robust है। kit खरीदनी पड़ती है, लेकिन यह पूरी तरह किया जा सकता है, और खुद gel डालने या radioactive-labeled Sanger reactions करने के दिनों से इसकी कोई तुलना नहीं है
      personal genomics company की जगह, labs के लिए sequencing outsourcing service देने वाली company को काम सौंपने का तरीका भी है। interpretation के जोखिम के बारे में मैं पूरी तरह सहमत हूँ

  • privacy के प्रति जागरूक हिस्सा मुझे अच्छा लगा। “Claude में चलाना” वाली साफ समस्या को छोड़ दें, तो मैं जानना चाहता/चाहती हूँ कि जिन analysis tools का उल्लेख हुआ है, उनमें से कितने पूरी तरह open source हैं या कम से कम local run किए जा सकते हैं
    अच्छा होता अगर लेख में इस हिस्से पर बात की गई होती

    • सरसरी नज़र से देखने पर लगता है कि सबने source code public किया है, और local पर भी चल जाते हैं

  • मुझे कैसे पता चलेगा कि जो result मुझे मिला है वह असली है, या बस बेकार data है?

    • इसे दूसरे nucleotide sequences के साथ compare करके देखा जा सकता है। इसे sequence alignment कहते हैं: https://en.wikipedia.org/wiki/Sequence_alignment
    • इसे कई बार चलाकर, experts से भी करवाकर, फिर एक-दूसरे से compare कर सकते हैं